PRÁCTICA 10: Medición de la concentración de hemoglobina
Objetivo: Realizar la determinación cuantitativa de la hemoglobina mediante la utilización del espectrofotómetro y los valores de absorbancia.
Fundamento: La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cian metahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.
Materiales: Papel de filtro, frasco lavador, 3 cubetas espectro, micropipeta (20-200 microlitros), puntas micropipeta, vaso de precipitado, 3 tubos de ensayo, gradilla, pipeta graduada 5ml y auxiliar de pipeteo, pipeta Pasteur, tubo Eppendorf.
Reactivos: reactivo de Drabkin (hemoglobina 50X) y calibrador (15g/dl)
Equipos: Espectrofotómetro.
Muestra: sangre venosa anticoagulada.
Procedimiento:
- Preparar los materiales y la zona de trabajo.
- Encender el espectrofotómetro a 540 nm.
- Rotular los tubos de ensayo y las cubetas: agua, blanco, muestra y patrón y echamos un poco de sangre de la bolsa a un tubo de ensayo.
- Añadimos 4,9 ml de agua destilada a cada tubo.
- Añadimos 2 gotas de reactivo de Drabkin en cada tubo.
- Añadimos 20 microlitros de calibrador al tubo rotulado con patrón.
- Añadimos 20 microlitros de sangre al tubo rotulado con muestra.
- Traspasamos el contenido de cada tubo a su correspondiente cubeta, limpiamos las paredes de las cubetas e incubamos 3 minutos a temperatura ambiente, las llevamos al espectrofotómetro.
- Leemos la absorbancia:
- Cubeta (agua)= 0 abs
- Cubeta (Blanco)= 0,002 abs
- Cubeta (Muestra)= 0,937 abs
- Cubeta (Patrón)= 0,410 abs
- Hombres= 14-18g/dl
- Mujeres= 12-16g/dl
- Obtenemos unos valores de 34,375 g/dl, son valores altos tanto para hombres como para mujeres, puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.
- Realizamos una curva patrón para saber la concentración.
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